IgG lieferte puma basket heart white keine Signale, die auf eine Immunpräzipitationsspezifität hinweisen. Die EGFR-PUMA-Wechselwirkung wurde über Reverse IP unter Verwendung eines PUMA-Antikörpers bestätigt (Fig. S2 in Supplemental Data). Ein früherer Bericht [36] zeigte, dass EGFR im Zytoplasma in freier, nicht membrangebundener Form vorliegen kann. In diesem Zusammenhang wird aktiviertes EGFR auf der Zelloberfläche endozytiert und zum ER transportiert, wo es mit Sec61beta, einer Komponente des Sec61-Translokons, assoziiert und dann als nicht membrangebundener Rezeptor vom ER zum Zytoplasma retrotransloziert wird. [37] . Unsere Ergebnisse in Abb. S2 in Supplemental Data zeigen, dass PUMA hauptsächlich mit dem EGFR-Protein interagiert, das nicht mit Plasmamembranen assoziiert ist.

Die Regressionsanalyse zeigte, dass die Expression von EGFR signifikant und positiv mit PUMA korreliert (p = 0,039, R = 0,9) und dass EGFR allein, PUMA allein und ihre Co-Expression signifikant und positiv mit dem Gliomgrad korrelierten (* EGFR / PUMA, p = 0,018) puma basket lack , R = 0,94; ** EGFR, p = 0,00005, R = 1,0; PUMA, p = 0,021, R = 0,93). (B) Repräsentative immungefärbte primäre Gliome. Oberes Feld: Ein primäres GBM, das sowohl für EGFR / EGFRvIII als auch für PUMA positiv gefärbt ist. Bodenplatte: Ein Grad II-Gliom, das puma basket platform beige für beide Proteine   eine negative Färbung zeigt. In diesen Studien wurden aufeinanderfolgende Tumorschnitte verwendet.

Wie erwartet zeigten unbehandelte Zellen keinen Hinweis auf Apoptose (Daten nicht gezeigt). Das Western Blot (3b) zeigte, dass die PUMA-Expression durch die PUMA-spezifische siRNA spezifisch und effizient herunterreguliert wurde. Auswirkungen der Herunterregulierung der PUMA-Expression und der erhöhten EGFRvIII-Expression auf die Induktion von Apoptose in GBM-Zellen. Das Ausmaß der Apoptose wird wie folgt berechnet: (Anzahl der apoptotischen Kerne) / (Gesamtanzahl der Kerne). In beiden Panels wurden 250-300 Zellen in jedem Experiment untersucht und drei unabhängige Experimente wurden durchgeführt, um Mittelwerte puma basket platform core und Standardabweichungen abzuleiten. (A) PUMA-Expressions-Knockdown macht GBM-Zellen resistent gegen Apoptose, wie durch den TUNEL-Assay angezeigt.

U87MG-Zellen wurden mit Kontroll-siRNA und PUMA-spezifischer siRNA 24 Stunden lang transfiziert und 48 Stunden lang 100 ng / ml Anisomycin, einem wirksamen Apoptose-Induktor, ausgesetzt. Die Zellen wurden dann dem TUNEL-Assay unterzogen, um das Ausmaß der Apoptose zu bestimmen. Rote Fluoreszenz: mit Propidiumiodid gefärbte Kerne. Grüne Fluoreszenz: fragmentierte DNA. Gelbe fusionierte Signale: Kernfragmentierte DNA. (B) Western Blot zeigt einen spezifischen und effizienten PUMA-Expressions-Knockdown nach der Transfektion von PUMA-spezifischer siRNA an, jedoch keine Kontrolle von nicht zielgerichteter siRNA. (C) Eine erhöhte EGFRvIII-Expression verleiht GBM-Zellen eine Resistenz gegen Apoptose.

Daher analysierten wir die zytoplasmatische / mitochondriale Verteilung von PUMA im isogenen Paar von U87MG-EGFRvIII- und U87MG-Vektorzellen. Die Mitochondrienfraktionierung / Western-Blotting (5a) zeigte, dass PUMA in erster Linie in den nicht mitochondrialen Fraktionen von U87MG-EGFRvIII-Zellen unter nicht belasteten Bedingungen lokalisiert war und sich nach Exposition gegenüber den apoptotischen Induktoren Staurosporin (ST) und einer moderaten mitochondrialen Translokalisierung unterzog Anisomycin (AN). Wie durch den niedrigen mtPUMA-Index (0-0,02) angezeigt, ist der Großteil von PUMA in den nicht mitochondrialen Fraktionen der EGFRvIII-exprimierenden U87MGEGFRvIII-Zellen sequestriert (5a).

Das Fehlen von ±-Tubulin puma basket platform metallic und Cox IV in den mitochondrialen bzw. nicht mitochondrialen Fraktionen zeigte die Wirksamkeit der Fraktionierung an. Niedrige mtPUMA-Indizes deuten darauf hin, dass PUMA hauptsächlich im Zytoplasma von U87MG-EGFRvIII-Zellen unter ungestressten und gestressten Bedingungen lokalisiert ist. (B) PUMA ist ausschließlich in den mitochondrialen Fraktionen von U87MG-Vektorzellen lokalisiert. U87MG-Vektorzellen wurden behandelt, fraktioniert und Proteine   analysiert, wie zuvor in Panel a beschrieben. Die mtPUMA-Indizes in diesen Zellen sind 1,0, was darauf hinweist, dass PUMA unabhängig von apoptotischem Stress ausschließlich in den Mitochondrien dieser Zellen nachgewiesen wird. (C) Der Abbau der EGFR-Expression durch siRNA führt zu einer erhöhten mitochondrialen Translokalisierung von PUMA.